PCR digitale

PCR digitale multiplex

Qu’est-ce que la PCR digitale multiplex ?

Le multiplexage en PCR permet la détection de plusieurs molécules cibles ou séquences dans une même réaction. Le multiplexage en PCR digitale (dPCR) peut être obtenu en variant les types de fluorophores utilisés. Dans le multiplexage multicolore classique, les cibles sont différenciées à l’aide d’une sonde par cible, la sonde étant conjuguée à des colorants de spectres d’émission différents. La plupart des instruments de dPCR proposent la détection de différents fluorophores sur au moins deux canaux de détection dédiés. Le QIAcuity Digital PCR System, par exemple, permet le multiplexage pour une distinction nette pouvant aller jusqu’à 12 cibles dans une même réaction.

Avantages du multiplexage en dPCR

Le multiplexage en dPCR est très intéressant compte tenu des nombreux avantages du multiplexage avec un système de dPCR. Cette approche peut être utilisée pour :

  • Analyser plusieurs cibles dans une même réaction
  • Réduire les erreurs techniques, comme les imprécisions de pipetage
  • Accroître les chances de détection des cibles
  • Réduire la quantité d’échantillons nécessaire à l’analyse
  • Permettre le contrôle interne direct d’une réaction individuelle
  • Gagner du temps et économiser les réactifs pour réduire le coût global

Le multiplexage avec la PCR digitale permet diverses applications qu’il est difficile, voire impossible, de réaliser avec des dosages à une seule couleur. Certaines de ces analyses incluent :

  • Variation du nombre de copies : appariement des gènes cibles et de référence pour déterminer leur rapport, avec une approche duplex
  • Variation bi-allélique de variants mononucléotidiques ou de petites insertions/délétions : approche duplex avec deux sondes d’hydrolyse, visualisées grâce à deux tracés en couleur (1)
  • Génotypage : décompte du nombre de fractions à partir de groupes positifs simples et doubles (1)
Pour bénéficier de tous les avantages du multiplexage en PCR digitale, choisissez un système de PCR digitale doté de capacités de multiplexage avancées.

Un instrument de PCR digitale doté de capacités élevées de multiplexage vous permet d’analyser plusieurs cibles dans un échantillon avec une sensibilité et une reproductibilité importantes. Le QIAcuity Digital PCR System, par exemple, existe en diverses configurations afin de répondre à tous vos besoins en matière d’analyse d’échantillon et de cible.

L’avantage de la PCR digitale sur nanoplaques pour les réactions multiplex

La PCR digitale multiplex est une approche prisée, il s’agit d’une méthode plus flexible, sensible et spécifique que la qPCR multiplex. Le multiplexage en qPCR peut également nécessiter des méthodes plus compliquées de calcul des valeurs absolues et cette méthode est davantage sensible aux interférences de plusieurs PCR dans une même réaction. Grâce aux fonctionnalités logicielles, comme une matrice de diaphonie personnalisée, vous pouvez corriger les signaux de diaphonie entre les canaux voisins sur la base de votre dosage et des paramètres de cycle d’exécution. Ceci permet de renforcer davantage votre capacité de multiplexage en dPCR, mais aussi la précision des données par rapport à la qPCR.

La PCR digitale sur nanoplaques présente des avantages non négligeables par rapport à d’autres types de PCR digitale, notamment des temps de cycles d’exécution plus courts, une précision et une sensibilité élevées et des capacités de multiplexage d’ordre élevé, y compris le multiplexage d’amplitude.

L’instrument QIAcuity offre six couleurs qui peuvent être utilisées pour la détection de cibles dans six canaux, plus deux canaux hybrides. Ces canaux hybrides sont utilisés pour les colorants à grand déplacement de Stokes (LSS). Comment fonctionnent ces colorants ? Le décalage spectral entre la lumière absorbée et la lumière émise dans les colorants LSS est plus long que celui des colorants fluorescents standard. En effet, l’absorption et l’émission sont gérées avec différents canaux. Par exemple, l’excitation survient avec la longueur d’onde du canal vert standard, tandis que l’émission / l’acquisition d’image est possible grâce au filtre jaune. Ceci facilite l’analyse jusqu’aux réactions 8-plex.

Pour des cibles encore plus nombreuses, vous pouvez essayer le multiplexage d’ordre élevé. Avec la possibilité du multiplexage d’amplitude sur QIAcuity, grâce au QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit, vous pouvez analyser jusqu’à 12 cibles. Le multiplexage d’amplitude quantifie simultanément deux cibles dans le même canal de couleur, doublant efficacement la sortie de données par réaction. Le logiciel QIAcuity (version 3.1 et version ultérieure) prend en charge le multiplexage d’amplitude en introduisant trois seuils ajustables dans le canal afin de faire la distinction entre la cible une, la cible deux et les doubles positifs. Grâce à ces seuils, vous pouvez analyser chaque’amplification de cible dans l’échantillon.

Les capacités avancées de multiplexage d’ordre élevé optimisent les ressources de laboratoire et fournissent une vue en haute résolution des variations génétiques. Ces fonctionnalités sont essentielles pour les applications comme la variation du nombre de copies (VNC) et la détection microbienne, en particulier lorsque les échantillons sont limités.

Fonctionnalités clés de la gamme QIAcuity

Fonctionnalités de haut débit et de multiplexage du QIAcuity* Digital PCR System pour une utilisation dans les recherches non cliniques et du QIAcuityDx** Digital PCR System pour une utilisation en diagnostic in vitro
  QIAcuity* One 2plex QIAcuity* One 5plex QIAcuity* Four QIAcuity* Eight QIAcuityDx** Four

Canaux de détection

 2 8a
(6+2 hybridesb)

8a
(6+2 hybridesb)

8a
(6+2 hybridesb)

 5
Capacité de multiplexage 4  12c,a  12c,a  12c,a 5

Nombre d’échantillons analysés
en une journée

Jusqu’à 384 

 Jusqu’à 384  

Jusqu’à 672 

Jusqu’à 1 248 

 Jusqu’à 672 (96 puits)d
Jusqu’à 168 (24 puits) 
But  Applications non cliniques Applications DIV

Vous avez d’autres questions sur le multiplexage en dPCR ? Voyons si notre QIAgenius peut y répondre :

Applications de la dPCR multiplex

Les dosages de dPCR multiplex peuvent être adaptés à de nombreuses applications de PCR digitale. Cela peut aller de la thérapie cellulaire et génique à la recherche de fraude alimentaire, en passant par la caractérisation des VAA, la détection microbienne et le dosage pour la variation du nombre de copies.
Les dosages de dPCR multiplex pour l’alimentation

Les dosages de PCR digitale multiplex trouvent de nombreux usages dans l’industrie alimentaire. En matière de contrôle réglementaire et d’assurance qualité, les dosages de dPCR multiplex peuvent permettre d’identifier une espèce animale et de détecter l’origine de la viande et des produits carnés, des espèces de poissons et d’autres espèces (2, 3). Avec le multiplexage en PCR digitale, vous pouvez par exemple distinguer sans difficulté diverses origines dans une même réaction : cochon, chameau, mouton, âne, chèvre, vache et poulet (2).

Le multiplexage en dPCR peut aussi être utilisé pour les tests d’OGM et la quantification de transgènes à l’aide de réactions de PCR multiplex permettant de déterminer le rapport transgène/endogène (4, 27). Dans une étude, des dosages par dPCR duplex ont été utilisés pour comparer les taux de transgènes MON810 à ceux d’un gène de référence HMG dans des échantillons de maïs. Le dosage par dPCR multiplex a atteint une sensibilité de cinq copies d’ADN cibles avec une meilleure répétabilité et une meilleure tolérance aux inhibiteurs présents dans les graines en poudre que la qPCR (5).

La fraude alimentaire constitue une autre application majeure du multiplexage en PCR digitale, par exemple pour détecter des ingrédients d’origine animale dans des produits végétariens ou végans transformés. Un dosage par dPCR multiplex basé sur l’amplification du gène mitochondrial cytochrome b, propre à bon nombre d’animaux, et de l’ADN chloroplastique, propre aux espèces de plantes, peut permettre de détecter des ingrédients d’origine animale dans des aliments végétariens (6). 

Enfin, la dPCR peut être utilisée pour détecter de graves maladies d’origine alimentaire. Grâce au multiplexage en PCR digitale, vous pouvez détecter simultanément des agents pathogènes microbiens tels que E. coli, L. monocytogenes, S. aureus et S. enterica (7).

mericon GMO Detection and Quant GMO kits, mericon Ingredient Authentication kits, DNeasy mericon Food kitApplied testing, food, safety testing, collecting samples from corn
La dPCR multiplex dans un dosage de la variation du nombre de copies

Dans un dosage de la variation du nombre de copies, le multiplexage en dPCR peut permettre d’apparier les gènes cibles et de référence afin de déterminer leur rapport à l’aide d’une approche duplex.

Dans une étude, le multiplexage en PCR digitale a permis de détecter simultanément des mutations génétiques, des fusions de gènes et des duplications de gènes (8). Il a également été possible d’évaluer simultanément le nombre de copies de deux oncogènes majeurs du neuroblastome avec deux gènes de référence diploïdes normaux, ce qui a permis d’économiser un échantillon précieux. Les dosages par dPCR multiplex ont affiché une spécificité et une sensibilité de 100 % dans la détection simultanée des mutations génétiques, des fusions de gènes et des duplications de gènes (9).

Autre exemple de dosage de la variation du nombre de copies avec multiplexage en dPCR, le génotypage d’échantillons d’amyotrophie spinale. Les auteurs de l’étude ont utilisé le multiplexage en PCR digitale pour quantifier les nombres de copies de SMN1 et SMN2 avec RPPH1 en guise de contrôle interne du gène de référence (10). Des études ont également démontré que le multiplexage en PCR digitale pouvait être utilisé pour détecter de façon précise et économique des délétions et des duplications importantes dans le gène BRCA1 (11), ainsi que l’amplification des gènes MET et HER2 dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) (28).

Une autre étude a mis au point et optimisé les dosages de dPCR multiplex pour la quantification des altérations du nombre de copies (CNA) dans 15 biomarques d’ADN génomique provenant d’échantillons (12) de carcinome épidermoïde ou normaux congelés.

3D Illustration of Chromosomal Translocation, Fusion Gene Explanation, 05/2017, (Illustration, 3D Illustration, Life science)
Vous voulez en savoir plus sur l’analyse de la VNC avec la dPCR ?
Regardez notre webinaire « Analyse multiplex de la variation du nombre de copies dans une biopsie liquide par dPCR : données préliminaires de patients présentant des tumeurs solides ».
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La quantification des mutations avec les dosages par dPCR multiplex

Le multiplexage des cibles d’ADN par dPCR est utile pour la quantification des mutations somatiques, la quantification absolue d’allèles et la détection des mutations rares. Des études ont démontré que les panels de dPCR multiplex pouvaient être utilisés pour l’analyse quantitative des mutations d’oncogènes dans l’ADN libre circulant (ADNlc) (13) et le plasma (14, 15).

Des données probantes soulignent la pertinence de trouver des concentrations optimales d’amorces et de sondes ainsi que des températures optimales d’élongation dans des réactions simplex. Vous devez également vérifier la compatibilité des amorces et la présence de « pluie » dans les réactions duplex. Vous pouvez ensuite passer à des combinaisons de réactions de dPCR multiplex plus complexes.

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Le multiplexage en dPCR pour la détection microbienne

Le multiplexage en dPCR est fréquemment utilisé pour détecter des espèces microbiennes. Par exemple, les dosages par dPCR multiplex peuvent permettre de tester rapidement des agents pathogènes bactériens, fongiques, viraux ainsi que les gènes de résistance correspondants (16, 17, 18, 19, 20). Les sensibilités de détection rapportées sont de l’ordre de 50 unités de copie par ml, une étude a même rapporté une sensibilité de la dPCR 104 fois supérieure à la qPCR pour la détection d’ADN bactérien dans le sang (21).

Une autre publication a développé des dosages par dPCR duplex et qPCR duplex afin d’évaluer les espèces de cyanobactéries dans le milieu naturel. Les auteurs ont trouvé que la qPCR était rapide et économique, mais que la dPCR offrait une exactitude, une précision et une résistance aux inhibiteurs de PCR bien supérieures (22).

L’inhibition et la concurrence entre les cibles constituent un vrai problème pour la qPCR multiplex, notamment pour les échantillons environnementaux, dans lesquels les cibles sont présentes en faibles quantités avec une grande quantité d’ADN de fond non cible. Le multiplexage en PCR digitale est capable de quantifier avec précision au moins deux cibles avec une concentration 1 000 fois supérieure, il constitue ainsi une solution viable face aux limites de la qPCR (22).

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La dPCR multiplex pour la détection microbienne vous intéresse ?
Alors, consultez notre poster scientifique sur la détection précise et sensible des cibles d’ADN et ARN microbien par dPCR sur nanoplaques.
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Les dosages par dPCR multiplex en biopharmaceutique

Dans l’industrie biopharmaceutique, le multiplexage en dPCR favorise les processus de fabrication et de contrôle qualité pour les anticorps monoclonaux (AcM), les vaccins, la thérapie cellulaire et génique et les biosimilaires (23, 24, 25, 26). Les dosages par dPCR multiplex peuvent contribuer à bien des aspects du contrôle qualité, de la détection des contaminants à la quantification de la teneur. Cette méthode permet un contrôle qualité efficace, car il est possible de tester plusieurs contaminants simultanément. 

Le multiplexage en dPCR est adapté aux applications nécessitant une quantification relative de précision d’une cible comparée à un gène domestique, ou si le vecteur développé apporte plusieurs gènes thérapeutiques et une fonction de silençage génique ou d’édition génique. Les chercheurs travaillant avec des matériaux provenant de patients peuvent également obtenir plus d’informations à partir d’un seul échantillon, éliminant le besoin de procéder à un rééchantillonnage et réduisant l’erreur humaine et le coût par réaction des réactifs.

group of dividing cells

Conditions d’une quantification de précision avec la PCR digitale multiplex

  • Optimiser les dosages individuels : validez chaque réaction avant le multiplexage en dPCR (vérifiez par exemple la présence de dimères)
  • Évaluer les amorces et les sondes : vérifiez l’éventuelle interaction entre vos amorces et vos sondes
  • Choisir les colorants avec soin : choisissez soigneusement les colorants pour chaque dosage, sélectionnez ceux qui contiennent un fluorophore brillant pour les cibles avec peu de copies
  • Vérifier les cibles liées : recherchez d’éventuelles cibles liées ou corrélations de cibles d’un ordre supérieur ; utilisez par exemple des dosages basés sur la liaison pour mesurer la configuration cis versus trans des cibles et les éventuels réarrangements structurels
  • Éviter l’hybridation croisée : concevez si possible des variations sonde/cible impliquant deux ou plusieurs délétions ou insertions de nucléotides afin d’éviter les mésappariements de sondes
  • Limiter l’infiltration optique : survient si la fluorescence d’un colorant est détectée par plusieurs canaux ; veillez si possible à ce que vos colorants conjugués correspondent aux systèmes de détection optique ou ajustez les paramètres de traitement du signal dans le logiciel d’analyse
  • Remédier aux problèmes de diaphonie : vérifiez que votre système dispose de fonctionnalités logicielles spécialisées, comme une matrice de diaphonie personnalisée, qui peut aider à analyser la diaphonie entre des canaux voisins pour tous les dosages multiplex et renforcer la confiance en vos données
  • Réduire la présence de « pluie » : la « pluie » fait référence au sous-ensemble de fractions qui sont supérieures aux fractions négatives, mais inférieures aux fractions positives. Vous pouvez réduire cette « pluie » en réévaluant le type de matrice, la confirmation, l’intégrité, la spécificité du dosage et la présence d’inhibiteurs dans la réaction ; définissez différemment la position de seuil afin que la « pluie » n’ait pas d’incidence sur la quantification
Quelques astuces en plus pour optimiser votre dosage par dPCR
Découvrez comment concevoir, résoudre les problèmes et optimiser les expériences de dPCR en parcourant notre page sur le développement de dosages par dPCR.
En savoir plus

Débuter avec la dPCR multiplex

Si vous souhaitez passer à la PCR digitale multiplex, il vous faudra investir dans un instrument de dPCR doté de capacités de multiplexage avancées. Il existe en outre de nombreux kits de dPCR et dosages de dPCR conçus pour les dosages par PCR digitale multiplex qui peuvent être intéressants à plus d’un titre pour les débutants comme pour les experts du multiplexage.

  • Votre instrument de PCR digitale : de nombreux types de systèmes de PCR digitale sont disponibles, mais certaines offrent plus d’options de multiplexage que d’autres. Grâce au système de dPCR QIAcuity, vous pouvez configurer des dosages 8-plex en multiplexant dans jusqu’à six canaux standard et deux canaux hybrides pour les colorants LSS. Si vous utilisez les canaux standard pour le multiplexage d’amplitude, vous pouvez augmenter les capacités de multiplexage de QIAcuity jusqu’à 12plex. 
Canal  Excitation (nm)  Émission (nm)  Exemples de fluorophores

Vert

463 – 503

519 – 549 

FAM™, EvaGreen®

Jaune 

513–534

551–565 

HEX™, VIC® 

Orange 

541–563

582–608

TAMRA™, Atto 550

Rouge 

568–594

613–655

ROX™, Texas Red®

Pourpre 

588–638

656–694 

Cy5®, Quasar 680

Far red 

651-690

709-759

Cy5.5, Atto 680, Atto 700

Vert/jaune 

463–503

551–565

DY-482XL (LSS V/J)*

Orange/rouge 

541–563

613–655

DY-540XL (LSS O/R)*

  • Vos kits de dPCR multifonction – Utilisez des kits de dPCR conçus pour les réactions multiplex. Le QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit est idéal pour les échantillons difficiles et le multiplexage au-delà de cinq cibles. Les QIAcuity Probe PCR Kits comprennent des Master Mix spécifiques pour quantifier jusqu’à cinq cibles avec une abondance très variée sur une QIAcuity Nanoplate. Le multiplexage en dPCR vous fait gagner du temps, faire des économies et préserver le matériel d’échantillon sans conséquence sur la qualité ou la validité des données.
  • Kits de dPCR pour les analyses sans contamination – Des kits spécialisés existent pour les applications nécessitant des Master Mix ultrapropres qui réduisent au minimum la contamination de l’ADN de fond. Le QIAcuity UCP Probe PCR Kit est parfait pour l’analyse microbienne ou pour les applications de contrôle qualité, telles que les tests d’ADN résiduel. Ces kits présentent une spécificité et une précision élevées dans la quantification de l’ADNg ou de l’ADNc dans des dosages par dPCR simplex ou 5-plex. 
  • Des dosages par dPCR multiplex propres à une application – Pour accroître le rendement et réduire les coûts selon les applications, nous avons conçu des dosages par dPCR avec différents colorants (FAM, HEX, ROX, Atto 500 et Cy5). Ces dosages de dPCR multiplex permettent une conception expérimentale flexible et des analyses multiplex allant jusqu’à cinq cibles dans une seule réaction. Il existe des dosages par dPCR spécifiques pour l’analyse de la VNC, la détection microbienne, la thérapie cellulaire et génique et les dosages de mutation des LNA pour les mutations liées au cancer.

Produits proposés pour la PCR digitale multiplex

Publications relatives au multiplexage en dPCR

La communauté scientifique a adopté très largement les dosages par dPCR multiplex et leurs avantages. Voici une liste de chercheurs publiés qui utilisent le multiplexage en PCR digitale :

Ressources supplémentaires concernant la dPCR multiplex

Autres références
  1. Whale AS, Huggett JF, Tzonev S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2016; 10:15–23.
  2. Izadpanah M et al. Simple and fast multiplex PCR method for detection of species origin in meat products. Journal of Food Science and Technology. 2017; 55(2): 698–703.
  3. Lee YM, Lee S, Kim HY. A multiplex PCR assay combined with capillary electrophoresis for the simultaneous identification of Atlantic cod, Pacific cod, blue whiting, haddock, and Alaska pollock. Foods. 2021; 10(11):2631.
  4. Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019. https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/WG-dPCR-Report.pdf.
  5. Dobnik D, Spilsberg B, Bogožalec K, Holst-Jensen A and Žel J. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction. Analytical Chemistry. 2015; 87(16):8218–8226.
  6. Lao TD, Le TAH. Exploring the multiplex PCR for detection of animal-derived ingredients in vegetarian foods. Pharmacopore. 2020; 3.
  7. Boukharouba A, González A., García-Ferrús M., Ferrús A. Botella S. Simultaneous detection of four main foodborne pathogens in ready-to-eat-food by using a simple and rapid multiplex PCR (mPCR) assay. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(3): 1031.
  8. Appay R et al. Multiplexed droplet digital PCR assays for the simultaneous screening of major genetic alterations in tumors of the central nervous system. Frontiers in Oncology. 2020; 10:579762.
  9. Peitz C et al. Multiplexed quantification of four neuroblastoma DNA targets in a single droplet digital PCR reaction. Journal of Molecular Diagnostics. 2020; 22(11):1309–1323.
  10. Jiang L et al. Development and validation of a 4-color multiplexing spinal muscular atrophy (SMA) genotyping assay on a novel integrated digital PCR instrument. Scientific Reports. 2020; 10: 19892.
  11. Oscorbin I, Kechin A, Boyarskikh U., Filipenko M. Multiplex ddPCR assay for screening copy number variations in BRCA1 gene. Breast Cancer Research and Treatment. 2019; 178(3):545–555.
  12. Hughesman CB et al. A robust protocol for using multiplexed droplet digital PCR to quantify somatic copy number alterations in clinical tissue specimens. PLOS ONE. 2016; 11(8): e0161274
  13. Yu Q. et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Molecular Medicine Reports. 2017; 16(2):1157–1166.
  14. Andersen RF And Jakobsen A. Screening for circulating RAS/RAF mutations by multiplex digital PCR. Clinica Chimica Acta. 2016; 458:138–143.
  15. Corné J et al. Development of multiplex digital PCR assays for the detection of PIK3CA mutations in the plasma of metastatic breast cancer patients. Scientific Reports. 2021; 11(1):17316.
  16. Dong L et al. A rapid multiplex assay of human malaria parasites by digital PCR. Clinica Chimica Acta. 2023; 539:70–78.
  17. Shi K et al. A multiplex crystal digital PCR for detection of African Swine Fever Virus, Classical Swine Fever Virus, and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. Frontiers in Veterinary Science. 2022; 9:926881.
  18. Wu, J et al. Clinical validation of a multiplex droplet digital PCR for diagnosing suspected bloodstream infections in ICU practice: a promising diagnostic tool. Crit Care. 2022; 26: 243.
  19. Zhu X et al. Development of a multiplex droplet digital PCR assay for detection of enterovirus, parechovirus, herpes simplex virus 1 and 2 simultaneously for diagnosis of viral CNS infections. Virology Journal. 2022; 19:70.
  20. Maggi R, Breitschwerdt EB, Qurollo B, Miller JC. Development of a multiplex droplet digital PCR assay for the detection of Babesia, Bartonella, and Borrelia species. Pathogens 2021; 10(11):1462.
  21. Shin J et al. Duplex dPCR system for rapid identification of gram-negative pathogens in the blood of patients with bloodstream infection: A culture-independent approach. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2021; 31(11):1481–1489.
  22. Te SH, Chen EY, Gin KYH. Comparison of Quantitative PCR and Droplet Digital PCR Multiplex Assays for Two Genera of Bloom-Forming Cyanobacteria Cylindrospermopsis and Microcystis. Applied and Environmental Microbiology. 2015; 81(15):5203–5211.
  23. Hayes D and Dobnik D. Commentary: Multiplex dPCR and SV-AUC are promising assays to robustly monitor the critical quality attribute of AAV drug product integrity. Journal of Pharmaceutical Sciences 111(8): 2143–2148.
  24. Nell RJ et al. Accurate quantification of T Cells in copy number stable and unstable DNA samples using multiplex digital PCR. Journal of Molecular Diagnostics. 2022; 24(1):88–100.
  25. Sanchez MEN et al. Multiplex reverse transcriptase droplet digital PCR for the simultaneous quantification of four dengue serotypes: Proof of concept study.2020; Biologicals 67:62–68.
  26. Meng P et al. Development of a multiplex dPCR assay for ERBB2 amplification in breast cancer. European Journal of Cancer. 2022; 175(1):S80.
  27. Morisset D, Štebih D, Milavec M, Gruden K, Žel J. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013; 8(5):e62583. 
  28. Oscorbin IP et al. Multiplex droplet digital PCR assay for detection of MET and HER2 genes amplification in non-small cell lung cancer. Cancers (Basel). 2022; 14(6):1458.
  29. Center for Breakthrough Medicines. https://breakthroughmedicines.com/all/tech-note-high-throughput-aav-viral-titering-using-nanoplate-based-digital-pcr/ (Accessible le 21 avril 2023)