デジタルPCR

マルチプレックスデジタルPCR

マルチプレックスデジタルPCRとは何ですか？

PCRにおけるマルチプレックス化では、1回の反応で複数のターゲット分子やシーケンスを検出できます。デジタルPCR（dPCR）を用いるマルチプレックス化は、使用する蛍光色素の種類を変えることで実現できます。従来のマルチカラーマルチプレックス化では、ターゲットごとに1つのプローブを使用し、発光スペクトルの異なる色素と結合したプローブを用いることでターゲットを区別します。ほとんどのdPCR装置では、少なくとも2つの専用検出チャンネルで異なる蛍光色素を検出します。一例としてQIAcuityデジタルPCRシステムでは、マルチプレックス化により同一反応で最大12のターゲットを明確に識別できます。

dPCRマルチプレックス化の利点

dPCRシステムによるマルチプレックス化には多くの利点があるため、dPCRマルチプレックス化は関心が高まっているテーマです。この手法は、次のような目的に使用できます：

  • 1回の反応で複数のターゲットを分析
  • ピペッティングの不正確さなどの技術的エラーを削減
  • ターゲット検出の可能性を高める
  • 分析に必要なサンプル量を削減
  • 個々の反応のダイレクト内部コントロールを提供
  • 時間と試薬を節約して、全体的なコストを削減

デジタルPCRによるマルチプレックス化により、シングルカラーアッセイでは実行できない、または容易に実行できないさまざまなアプリケーションが可能になります。このような分析には次のようなものがあります。

  • コピー数変異：2プレックスのアプローチにより、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子をペアリングし、その比率を決定
  • 一塩基変異や小さな挿入/欠失の二対立遺伝子変異：2つの加水分解プローブを用いる2プレックスのアプローチで、2つのプロットを用いて可視化（1）
  • 遺伝子型決定：シングルおよびダブルポジティブクラスターからパーティション数を計数（1）
デジタルPCRマルチプレックス化の利点を最大限に活用するには、高度なマルチプレックス機能を備えたデジタルPCRシステムをご検討ください。

高次マルチプレックス機能力を備えたデジタルPCR装置では、1つのサンプルの複数のターゲットを、高い感度と再現性で分析することができます。たとえば、QIAcuityデジタルPCRシステムには、サンプルやターゲット分析のニーズに合わせて、いくつかの構成が存在します。

マルチプレックス反応におけるナノプレートデジタルPCRの利点

マルチプレックスデジタルPCRは、マルチプレックスqPCRよりも柔軟性、感度、特異性が高いため、好ましいアプローチといえます。qPCRによるマルチプレックス化では、絶対値を計算するためにより複雑な方法が必要になる可能性もあり、この方法は1つの反応で複数のPCRが干渉される可能性が高くなります。カスタムクロストークマトリックスなどのソフトウェア機能があれば、実施するアッセイと実行パラメーターに基づいて、隣り合うチャンネルとのクロストークに対処できます。この機能により、dPCRマルチプレックス機能やデータの正確さが、qPCRと比較して向上します。

ナノプレートデジタルPCRは、短いラン時間、高い精度と感度、振幅マルチプレックス化をはじめとする高次マルチプレックスオプションを備えています。

QIAcuity装置は6色の色素に対応し、6つのチャンネルと2つのハイブリッドチャンネルでターゲットの検出に使用できる6つの色をご使用になれます。ハイブリッドチャンネルは、ロングストークスシフト（LSS）を持つ色素に使用します。LSS色素はどのような点で好都合なのでしょうか？LSS色素は、吸収光と放射光間のスペクトルシフトが標準の蛍光色素よりも長くなります。そのため、吸収と放射を別々のチャンネルで処理されます–たとえば、励起は、標準のグリーンのチャンネルの波長で起きますが、放射/画像取得はイエローのフィルターを通して検出されます。そのため、最大8プレックスの反応解析が容易になります。

さらに多くのターゲットの場合は、高次マルチプレックス化を試すことができます。QIAcuityは振幅マルチプレックス化が可能で、QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kitを用いると最大12のターゲットを解析できます。振幅マルチプレックス化により、同じカラーチャンネルで2つのターゲットが同時に定量でき、反応あたりのデータ出力は実質的に2倍になります。QIAcuityソフトウェア（バージョン3.1以降）は、チャンネル内に3つの調整可能な閾値を導入し、ターゲット1、ターゲット2、ダブルポジティブを識別できます。このようにして振幅マルチプレックスがなされます。これらの閾値を設定することで、サンプル中の各ターゲットの増幅を解析することができます。

先進的な高次マルチプレックス機能は、ラボの資源を最適化し、遺伝的変異を高解像度で表示します。このような機能は、特にサンプルが限られている場合に、コピー数多型や微生物の検出などのアプリケーションに重要です。

QIAcuityファミリーの主要機能

QIAcuity*デジタルPCRシステム（非臨床研究用）、QIAcuityDx**デジタルPCRシステム（体外診断用）のハイスループットおよびマルチプレックス機能
  QIAcuity* One 2plex QIAcuity* One 5plex QIAcuity* Four QIAcuity* Eight QIAcuityDx** Four

検出チャンネル

 2 8a
（6+2ハイブリッドb）

8a
（6+2ハイブリッドb）

8a
（6+2ハイブリッドb）

 5
マルチプレックス機能 4  12c,a  12c,a  12c,a 5

1就業日に
分析可能なサンプル数

最大384 

 最大384  

最大672 

最大1248 

 最大672（96ウェル）d
最大168（24ウェル） 
用途 非臨床アプリケーション IVDアプリケーション

dPCRマルチプレックス化に関する初歩的な質問がまだありますか？弊社のQIAgeniusがお答えできるかもしれません。

マルチプレックスdPCRのアプリケーション

マルチプレックスdPCRアッセイは、さまざまなデジタルPCRアプリケーションをサポートできます。細胞および遺伝子治療から、食品偽装検査、AAV特性評価、微生物の検出、コピー数多型アッセイなど、多岐にわたります。
食品アプリケーション向けのマルチプレックスdPCRアッセイ

マルチプレックスデジタルPCRアッセイは、食品産業に多くの用途があります。食品の規制管理や品質保証では、マルチプレックスdPCRアッセイを適用して、動物種の識別や、肉や肉製品、魚種などの起源を検出できます（2、3）。たとえば、デジタルPCRマルチプレックス化を使用すると、1回の反応で、ブタ、ラクダ、ヒツジ、ロバ、ヤギ、ウシ、ニワトリの起源の識別に成功します（2）。

dPCRによるマルチプレックス化は、GMO検査、transgene-endogene（導入遺伝子-内在遺伝子）のマルチプレックスPCR反応による導入遺伝子の定量にも利用できます（4、27）。ある試験では、2プレックスdPCRアッセイを使用して、トウモロコシ飼料サンプル中のMON810導入遺伝子レベルとHMGリファレンス遺伝子レベルを比較しました。マルチプレックスdPCRアッセイでは、5つのターゲットDNAコピーの感度を得ることができ、これは、qPCRよりも優れた再現性と、種子粉末阻害剤に対する耐性を示しました（5）。

食品偽装検査は、デジタルPCRによるマルチプレックス化のもう一つの主要なアプリケーションであり、たとえば、ベジタリアンやビーガンの加工製品に含まれる動物由来成分の検出に使用されます。ほとんどの動物に特異的なミトコンドリアシトクロムb遺伝子と、植物種に特異的な葉緑体DNAの増幅に基づくマルチプレックスdPCRアッセイを使用して、ベジタリアン食品中の動物由来成分を検出できます（6）。 

最後に、 dPCR は、重篤な食中毒の検出に使用できます。デジタルPCRによるマルチプレックス化により、 E. coli, L. monoytogenes, S. aureus 、 S. enetrica などの微生物病原体を同時に検出できます（7）。

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コピー数多型アッセイにおけるマルチプレックスdPCR

コピー数多型アッセイでは、dPCR によるマルチプレックス化を使用してターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子をペアにし、2プレックスアプローチを用いてその比率を決定できます。

ある研究では、デジタルPCRマルチプレックス化を使用して、遺伝子変異、遺伝子融合、遺伝子重複の同時検出に成功しています（8）。また、神経芽腫の2つの主要ながん遺伝子と2つの正常な二倍体リファレンス遺伝子の同時コピー数評価も行うことができ、貴重なサンプルを節約することができました。マルチプレックスdPCRアッセイは、遺伝子変異、融合、重複の同時検出において、100%の特異性と感度を示しました（9）。

dPCRマルチプレックス化によるコピー数多型アッセイのもう一つの例は、脊髄性筋萎縮症（SMA）サンプルの遺伝子型決定です。この研究者らは、デジタルPCRによるマルチプレックス化を用いて、RPPH1をリファレンス遺伝子内部コントロールとして使用し、SMN1とSMN2のコピー数を定量しました（10）。また、この研究では、デジタルPCRマルチプレックス化を使用して、BRCA1遺伝子の大規模な欠失や重複を正確かつコスト効率よく検出できるだけでなく（11）、非小細胞肺がん（NSCLC）におけるMETとHER2増幅も検出できることが示されています（28）。

別の試験では、凍結した正常および扁平上皮がん（SCC）サンプル由来の15種類のゲノムDNAバイオマーカーのコピー数変化（CNA）を定量するために、 マルチプレックスdPCRアッセイ を開発し、最適化しました（12）。

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マルチプレックスdPCRアッセイを使用する変異の定量

 dPCR によるDNAターゲットのマルチプレックス化は、体細胞変異の定量、対立遺伝子絶対定量、希少な変異検出に有益です。研究により、マルチプレックスdPCRパネル が、セルフリーDNA （cfDNA）（13）と血漿 （14、15）中のがん遺伝子突然変異の定量分析に使用できることが示されています。

エビデンスから、シングルプレックス反応では最適なプライマーとプローブの濃度、最適な伸長温度を見つけることが有意義であることが示唆されます。また、2プレックス反応ではプライマーセットの互換性とレインの存在も確認する必要があります。その後、より複雑なマルチプレックス dPCR 反応における組み合わせに進むことができます。

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微生物検出のためのdPCRによるマルチプレックス化

デジタルPCRによるマルチプレックス化は、微生物種の検出によく使用されています。たとえば、マルチプレックスdPCRアッセイは、細菌性病原体、真菌性病原体、ウイルス性病原体、および関連する耐性遺伝子を迅速に検査できます（16、17、18、19、20）。報告されている検出感度は1 mLあたり50コピー単位と低く、ある研究では血液中の細菌DNA検出のdPCRの感度は、qPCRの104倍と報告されています（21）。

別の公表文献では、自然環境におけるシアノバクテリア種を評価するために、2プレックスdPCRおよび2プレックスqPCRアッセイが開発されました。著者らは、qPCR は迅速かつ経済的であるものの、dPCRの方がより高い精度、正確さ、PCR阻害に対する抵抗性を持つことを明らかにしています（22）。

特に、ターゲットが少量なのに対し非ターゲットバックグラウンドDNAが大量に存在する環境サンプルでは、ターゲット間の阻害と競合は、マルチプレックスqPCRの大きな課題です。デジタルPCRマルチプレックス化は、濃度に1000倍の差がある少なくとも2つのターゲットを正確に定量できることが示されており、このようなqPCRの限界において、実行可能な解決策を提供します（22）。

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バイオ医薬品におけるマルチプレックスdPCRアッセイ

バイオ医薬品業界では、dPCRマルチプレックスは、モノクローナル抗体（MAB）、ワクチン、細胞治療、遺伝子治療、バイオシミラーなどの製造および品質管理プロセスをサポートしています（23、24、25、26）。マルチプレックス化dPCRアッセイ は、汚染物質の検出から力価の定量に至るまで、品質管理のさまざまな面に貢献できます。この方法では、複数の汚染物質を同時に検査することができるため、効率的な品質管理が可能です。 

dPCRによるマルチプレックス化は、ハウスキーピング遺伝子と比較して、ターゲットの正確な相対定量が必要なアプリケーションや、開発中のベクターが複数の治療用遺伝子とサイレンシング遺伝子または遺伝子編集機能のいずれかを提供する場合に適しています。また、患者由来の材料を扱う研究者は、1つのサンプルからより多くの情報を得ることができるため、再サンプリングの必要がなく、ヒューマンエラーや反応あたりの試薬コストを削減できます。

group of dividing cells

マルチプレックスデジタルPCRで正確な定量を行うための留意点

  • 個々のアッセイを最適化：dPCRマルチプレックス化の前に個々の反応を検証します（たとえば、ダイマーの発生をチェック）
  • プライマーとプローブを評価：プライマーとプローブの相互作用の可能性をチェック
  • 色素を慎重に選択：各アッセイの色素を慎重に選択。低コピーターゲットには明るい蛍光色素を持つ色素を選択
  • リンクしたターゲットをチェック：リンクしたターゲットまたは高次ターゲット相関の可能性を調査します。たとえば、リンケージベースのアッセイを使用して、ターゲットのシス対トランスの構成と潜在的な構造再配置を測定
  • クロスハイブリダイゼーションを回避：可能であれば、プローブのミスマッチを避けるために、2つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を含むプローブとターゲットのバリエーションを設計
  • 光学的な漏れ込みを最小限に抑制：色素の蛍光が複数のチャンネルで拾われる場合に発生します。可能であれば、共役色素が光学検出システムに一致していることを確認するか、解析ソフトウェアのシグナル処理パラメーターを調整
  • クロストークの問題を解決：システムにカスタムのクロストークマトリックスなどの特別なソフトウェア機能があるかを確認してください。この機能があれば、すべてのマルチプレックスアッセイでも、隣り合うチャンネルとのクロストークを解析し、データの信頼性が向上
  • レインの存在を低減：レインとは、陰性パーティションよりも高いが、陽性パーティションより低いパーティションのサブセットを表します。テンプレートの種類、確認、整合性、アッセイ特異性、反応中の阻害物質の存在を再評価することで、レインを減らすことができます。レインが定量に与える影響を避けるため、閾値の位置を変えて設定することを検討してください。
dPCRアッセイ最適化のための、その他のヒント
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マルチプレックスdPCRを開始する

マルチプレックスデジタルPCRの実施にご関心がある場合は、高度なマルチプレックス機能を備えたdPCR装置への投資をぜひご検討ください。マルチプレックスデジタルPCRアッセイ用に開発されたdPCRキットやdPCRアッセイも多数あり、マルチプレックスの初心者と専門家の両方にさまざまなメリットをもたらします。

  • デジタルPCR装置 – デジタルPCRシステムにはさまざまな種類がありますが、中には他のシステムよりも多くのマルチプレックスオプションを提供するシステムもあります。QIAcuity dPCRシステムでは、最大6つの標準チャンネルとLSS色素用の2つのハイブリッドチャンネルでマルチプレックス化することにより、8プレックスのアッセイを設定できます。さらに振幅マルチプレックス化に標準チャンネルを使用すると、QIAcuityのマルチプレックス機能を12プレックスに増やすことができます。
チャンネル  励起（nm）  発光（nm）  蛍光色素の例

グリーン

463 – 503

519 – 549 

FAM™、EvaGreen®

イエロー 

513–534

551–565 

HEX™、VIC® 

オレンジ 

541–563

582–608

TAMRA™、Atto 550

レッド 

568–594

613–655

ROX™、Texas Red®

クリムゾン 

588–638

656–694 

Cy5®、Quasar 680

遠赤 

651-690

709-759

Cy5.5、Atto 680、Atto 700

グリーン/イエロー 

463–503

551–565

DY-482XL （LSS G/Y）*

オレンジ/レッド 

541–563

613–655

DY-540XL （LSS O/R）*

  • 多目的dPCRキット – マルチプレックス反応用に開発されたdPCRキットの使用をご検討ください。QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kitは、難しいサンプルやターゲットを5つ以上のターゲットのマルチプレックス化に最適です。QIAcuityプローブPCRキットには、QIAcuityナノプレート上で存在量が大きく異なる最大5つのターゲットを定量することができる特別なマスターミックスが含まれています。dPCRマルチプレックス化により、データの品質や有効性に影響を与えることなく、時間、コスト、サンプル材料を節約できます。
  • コンタミネーションのない分析用のdPCRキット – バックグラウンドDNAのコンタミネーションを最小限に抑えるウルトラクリーンなマスターミックスを必要とするアプリケーションには、専用のキットがあります。QIAcuity UCPプローブPCRキットは、微生物分析や残存DNA検査などの品質管理アプリケーションに最適です。このキットは、シングルプレックスまたは5プレックスdPCRアッセイで、gDNAやcDNAの定量において高い特異性と精度を提供します。 
  • アプリケーション特異的dPCRマルチプレックスアッセイ – 特定のアプリケーションに応じてスループットを向上させ、コストを削減するのため、さまざまな色素（FAM、HEX、ROX、Atto 500、Cy5）を使用したdPCRアッセイを開発しました。このマルチプレックスdPCRアッセイにより、柔軟な実験設計が可能になり、1回の反応で最大5つのターゲットのマルチプレックス解析が可能です。特定のdPCRアッセイは、CNV解析、微生物検出、細胞および遺伝子治療、がん関連変異のLNA変異アッセイに使用できます。

マルチプレックスデジタルPCRの注目製品

dPCRマルチプレックス化に関する出版物

科学界はdPCRマルチプレックスアッセイの利点を全面的に認めています。デジタルPCRマルチプレックスアプローチを使用して発表している研究者の厳選リストをご覧ください。

マルチプレックスdPCRに関するその他の情報

その他の参考文献
  1. Whale AS, Huggett JF, Tzonev S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2016; 10:15–23.
  2. Izadpanah M et al. Simple and fast multiplex PCR method for detection of species origin in meat products. Journal of Food Science and Technology. 2017; 55(2): 698–703.
  3. Lee YM, Lee S, Kim HY. A multiplex PCR assay combined with capillary electrophoresis for the simultaneous identification of Atlantic cod, Pacific cod, blue whiting, haddock, and Alaska pollock. Foods. 2021; 10(11):2631.
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