'Sticky' oder 'blunt': Modifikation, Annealing und Ligation
Enzyme für die Klonierung
Eine Endmodifikation kann erforderlich sein, damit die Template-DNA in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert werden kann. Die für die Klonierung identifizierte DNA wird in der Regel durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder PCR-Amplifikation aus der Quelle isoliert. Spezialisierte Enzyme wie das Klenow-Fragment, die T4-DNA-Polymerase und die T4-Polynukleotidkinase modifizieren 3’- oder 5’-Enden, um die kovalente Bindung zwischen DNA-Fragmenten und Vektor zu verbessern.
Der nächste Klonierungsschritt ist die Ligation mit einem Enzym, das sich für das Annealing der Enden von Vektor und Insert eignet.
Tailing erfolgt in der Regel zur Vorbereitung eines T-Vektors für die Verwendung in der TA-Klonierung oder für die Polyadenylierung bei einem durch eine High-Fidelity-Polymerase (nicht Taq) erzeugten PCR-Produkt, das in der TA-Klonierung verwendet werden soll. Die Produkte der Amplifikation mittels Taq-DNA-Polymerase weisen bereits einen Poly(A)-Schwanz auf.
DNA-Endmodifikation
* Die 3’→5’-Exonuklease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase ist wesentlich für das Protokoll zur sequenz- und ligationsunabhängigen Klonierung (SLIC).
† Die Konversion in DNA mit stumpfen Enden wird durch Ausnutzen der 5’→3’-Polymerase- und der 3’→5’-Exonuklease-Aktivitäten der T4-DNA-Polymerase (P7080) erreicht. Die T4-Polynukleotidkinase (Y9040) sorgt dafür, dass die stumpfen Enden der DNA-Fragmente zur Vorbereitung auf die nachfolgende Ligation durch T4-DNA-Ligase am 5’-Ende phosphoryliert werden.
DNA-Ligation
† Thermostabil; für die genaue Ligation von Nicks ohne Lücken oder Basenfehlpaarungen.
Klonierung auf die raffinierte SLIC-Art
Die sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung (SLIC) nutzt die Exonuklease-Enzymaktivität:
Klonierung für Next Generation Sequencing
Eine für Next Generation Sequencing vorgesehene Bibliothek geht von fragmentierter DNA aus. Enzymaktivitäten vervollständigen die Klonierungsschritte.
Alle erforderlichen Enzymkomponenten für die DNA-Bibliothekserstellung können mit Adaptern zu einem „selbstgemachten“ Bibliothekserstellungs-Kit zusammengestellt werden.
Gensynthese
Die Gensynthese basiert auf der Verbindung von Oligodesoxynukleotiden, die lange Regionen komplementärer Überhänge aufweisen.
Entdecken Sie die vorgestellten Enzyme für Klonierung und DNA-Rekombination
FAQs über Enzyme für Klonierung und Rekombination
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