QuantiFast Pathogen +IC Kits

• Gleichzeitiger Nachweis des Erreger-Ziels und der internen Kontrolle
• 5x Master-Mix für höhere Sensitivität bei größeren Probenmengen
• Korrekte Interpretation negativer Ergebnisse für erhöhte Prozesssicherheit
• Eindeutiger Nachweis von schwach-positiven Zielsignalen
• Schnelles, universelles Protokoll für Standard- und Fast-Thermocycler

QuantiFast Pathogen +IC Kits wurden für den sensitiven und schnellen Real-time-PCR- oder Ein-Schritt-RT-PCR-Nachweis von Pathogen-Nukleinsäuren mit sequenzspezifischen Sonden entwickelt. Um eine hohe Prozesssicherheit durch die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse zu ermöglichen, enthält jedes Kit Reagenzien für den Real-time-Nachweis im Multiplex-Format von bis zu 4 benutzerdefinierten Erreger-Zielen (z. B. Viren, Bakterien, Pilze usw.) sowie der internen Kontrolle (IC). Das Kit ist in zwei Formaten erhältlich: Das QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit für den Nachweis viraler RNA, das ein internes RNA-Kontroll-Template sowie das Internal Control Primer/Sonden-Set enthält, oder das QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit für den Nachweis viraler, bakterieller oder Pilz-DNA, das ein internes DNA-Kontroll-Template sowie das Internal Control Primer/Sonden-Set enthält. Bei beiden Kits wird ROX in 2 Röhrchen mit unterschiedlichen Konzentrationen bereitgestellt, sodass die Kits auf praktisch jedem Real-time-Gerät verwendet werden können. Der Master-Mix kann bei 2–8 °C gelagert werden.

QuantiFast Pathogen +IC Kits ermöglichen den gleichzeitigen Nachweis von viralen RNA- oder DNA-Zielen sowie der mitgelieferten internen Kontrolle über einen breiten linearen Bereich, ohne Sensitivitätsverluste in Multiplex-Reaktionen (siehe Abbildungen „ Sensitiver Nachweis des Norovirus auf dem Rotor-Gene Q“ und „ Hohe Linearität und Präzision beim Singleplex- und Duplex-Nachweis“). Das Protokoll wurde entwickelt, um schnelle Cycling-Experimente auf den meisten Thermocyclern mit hoher Zuverlässigkeit durchzuführen (siehe Abbildungen „ Sensitiver Nachweis von BHV-1 auf dem Rotor-Gene Q“ und „ Sensitiver Nachweis von BHV-1 auf dem ABI 7500“). Die kombinierte Amplifikation des Erreger-Ziels und der internen Kontrolle mit den QuantiFast Pathogen +IC Kits erhöht die Prozesssicherheit des Erregernachweis-Workflows, indem sie die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse gewährleistet (siehe Abbildung „ Korrekte Interpretation negativer Ergebnisse“).

Der in den Kits enthaltene QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer stabilisiert die RNA- und DNA-Standards während der Verdünnung und des Reaktionsansatzes und verhindert den Verlust von Nukleinsäuren durch Adsorption an Kunststoffoberflächen, wie z. B. Röhrchen oder Pipettenspitzen. Er ermöglicht eine zuverlässige Verdünnung von Standards, die zur Quantifizierung viraler Nukleinsäuren verwendet werden, und zeichnet sich durch einen breiten linearen Bereich aus, der von niedrigen bis zu hohen C_T-Werten reicht. Der Puffer sorgt für eine längere Lagerung der Standards ohne Abbau (siehe Abbildung „ Zuverlässige Verdünnung und Lagerung von RNA-Standards“).

Um eine hohe Prozesssicherheit durch die korrekte Interpretation negativer Ergebnisse zu ermöglichen, enthält jedes QuantiFast Pathogen +IC Kit Reagenzien für den Multiplex-Real-time-Nachweis von benutzerdefinierten Erreger-Zielen mit der internen Kontrolle. Die Amplifikation von Kontroll- und Zielgenen in derselben Reaktion statt in getrennten Reaktionen erhöht die Zuverlässigkeit der Genquantifizierung, da Handhabungsfehler minimiert werden.

Die QuantiFast Pathogen +IC Kits ermöglichen auf Anhieb einen sensitiven und schnellen Nachweis von Pathogen-Nukleinsäuren mittels Multiplex-Real-time-PCR oder Ein-Schritt-RT-PCR (siehe Flussdiagramm „ QIAGEN Multiplex-Kits“). Der optimierte Master-Mix sorgt dafür, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in einer entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktion. Der speziell entwickelte schnelle PCR-Puffer enthält das neuartige Additiv Q-Bond, das die für die Denaturierung, Hybridisierung und Extension benötigte Zeit erheblich verkürzt (siehe Abbildung „ Schnelle Primerhybridisierung“). Eine ausgewogene Kombination aus K⁺- und NH₄⁺-Ionen sowie der einzigartige synthetische Faktor MP sorgen für eine stabile und effiziente Hybridisierung von Primern und Sonden an das Nukleinsäure-Template und ermöglichen so eine hohe PCR-Effizienz (siehe Abbildung „ Einzigartiger PCR-Puffer“). Darüber hinaus sorgt die einzigartige Formulierung der Sensiscript Reverse Transcriptase für eine hoch sensitive reverse Transkription viraler RNA, während die HotStarTaq Plus DNA Polymerase einen stringenten Hot-Start gewährleistet und die Bildung unspezifischer Produkte verhindert.

QuantiFast Pathogen +IC Kits bieten ein einfaches Verfahren für den Nachweis eines benutzerdefinierten Erregers und der internen Kontrolle. Sie enthalten einen gebrauchsfertigen Master-Mix für den Real-time-Nachweis von viraler RNA (Ein-Schritt-RT-PCR) oder viraler, bakterieller und Pilz-DNA (PCR). Eine Optimierung der Reaktions- und Zyklusbedingungen ist nicht erforderlich. Mischen Sie einfach den mitgelieferten Master-Mix mit dem Pathogen-Assay (Primer und Sonde) und dem mitgelieferten Internal Control Assay und der Internal Control DNA oder RNA. Wenn die interne Kontrolle im Rahmen der Probenaufreinigung zugegeben wurde, fügen Sie dem Reaktionsgemisch statt der Internal Control DNA oder RNA RNase-freies Wasser zu. Geben Sie dann Ihre DNA- oder RNA-Probe hinzu, und starten Sie die Reaktion auf einem beliebigen Thermocycler. Das Kit-Handbuch enthält optimierte Protokolle für die Verwendung mit TaqMan®-Sonden auf einer Vielzahl unterschiedlicher Thermocycler. Außerdem enthält es Empfehlungen für die Auswahl von Farbstoffkombinationen.

Jedes QuantiFast Pathogen +IC Kit enthält den Internal Control Assay und Internal Control DNA oder RNA zur Verwendung als Amplifikationskontrolle, die direkt zum Reaktionsgemisch zugegeben wird. Alternativ kann die interne Kontrolle auch zum Aufreinigungsverfahren zugegeben werden, um sowohl den Aufreinigungsprozess als auch die Amplifikation zu überprüfen. Für die Zugabe der internen Kontrolle während der Aufreinigung sind hochkonzentrierte Internal Control DNA oder RNA (High conc.) separat bestellbar (siehe Abbildung „ QIAGEN Internal Control“).

QuantiFast Pathogen +IC Kits bieten eine sensitive Real-time-PCR oder Ein-Schritt-RT-PCR mit sequenzspezifischen Sonden für den Nachweis von Pathogen-DNA und/oder -RNA, einschließlich einer internen Kontrolle. Die Kits können auf einer breiten Palette unterschiedlicher Real-time-Thermocycler verwendet werden, darunter Thermocycler von QIAGEN, Applied Biosystems, Bio-Rad, Roche (außer Kapillar-Thermocycler) und Agilent.