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REPLI-g Mitochondrial DNA Kit (25)
カタログ番号 / ID. 151023
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 25 x 50 μl mitochondrial DNA specific whole genome amplification reactions
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REPLI-g Mitochondrial DNA Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。
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特徴
- 様々なスタートサンプルから高感度な増幅
- ヒトおよびヒト以外のミトコンドリア全ゲノムの均一な増幅
- 時間のかかるミトコンドリアDNAの精製が不要
- 損傷核DNAを持つサンプルからも有用な結果
- Blood cardや毛髪からのDNA増幅も可能
製品詳細
REPLI-g Mitochondrial DNA Kitを用いることにより、ミトコンドリアDNAを事前に精製することなく、トータルDNAから選択的にミトコンドリアDNAを増幅できます。本キットにはDNAポリメラーゼ、バッファー、試薬が含まれ、トータルDNA中の微量のミトコンドリアDNAサンプルから特異的かつ均一なミトコンドリアの全ゲノムDNA増幅を実現します。ヒト以外の生物種のミトコンドリアDNA を選択的に増幅されたい場合は、キットに含まれているREPLI-g Human mt Primer Mixではなく、適切なPrimer Mix をご用意ください。REPLI-g Mitochondrial DNA Kit は、Multiple Displacement Amplification（MDA）テクノロジーにより、簡単な操作で核DNAのコンタミがほとんどないミトコンドリアDNAの全ゲノム増幅を実現するため、時間のかかるミトコンドリアDNA精製の必要がなく、ダウンストリームアッセイの感度を向上できます。
パフォーマンス
通常のトータルDNA調製では、トータルDNAサンプルの約0.1％がミトコンドリアDNAです（例：0.1 ngのヒトトータルDNA は0.1 pgのミトコンドリアDNAを含む）。REPLI-g Mitochondrial DNA Kitはヒトミトコンドリアの全ゲノム領域を特異的に増幅し、反応あたり約4 µgの増幅ミトコンドリアDNAが得られます。スタートサンプル量に依存しますが、この値はミトコンドリアDNAが最高4千万倍に増幅されることになります（図" ミトコンドリアDNAの増幅"）。増幅後に残ったゲノムDNA量はわずかであり、定量PCRまたは直接サンガーシークエンシングなど、ミトコンドリア特異的なダウンストリーム法には干渉しません。
図参照
原理
ミトコンドリアDNAを使用する際の1つの制限は、核DNAからミトコンドリアDNAを精製しなければならないことでした（特にミトコンドリアDNAマーカーのアッセイ感度を高める必要がある場合に重要）。この精製操作には時間のかかる多くのステップが必要であり、ミトコンドリアDNAをかなり損失することになります。REPLI-g Mitochondrial DNA KitはトータルDNAサンプル中のミトコンドリアDNA配列を増幅することで、この問題を解決しています。
REPLI-g Mitochondrial DNAテクノロジーは、ミトコンドリアのゲノムDNA領域の迅速で均一な全ゲノム増幅を実現します。この方法は、伸長性が高いユニークなDNAポリメラーゼを用いて等温でゲノム増幅ができるMultiple Displacement Amplification（MDA）テクノロジーを利用しています。REPLI-g DNA Polymeraseは高い伸長性と相補鎖置換能により、DNAテンプレートから解離せずに最高100 kbまでの増幅ができます。 そのため、PCRベースの全ゲノム増幅法と比べミスマッチ配列と遺伝子座を最小限に抑えます。
操作手順
REPLI-g Mitochondrial DNA Kitを用いて2つの基本的ステップでミトコンドリアDNAを簡単に増幅できます（フローチャート" 精製したミトコンドリアDNAの操作手順"）。まずヒトのトータルDNAサンプルをREPLI-g Human mt Primer Mixと一緒に75 ℃で5 分間インキュベートすることにより変性し、その後冷却して変性を停止します。ヒト以外の生物種のミトコンドリアDNA の変性にはREPLI-g Human mt Primer Mixではなく、生物種に適したPrimer Mix をご用意ください。次にREPLI-g DNA Polymeraseを添加し、33 ℃で8 時間等温増幅反応を行ないます。
図参照
アプリケーション
REPLI-gテクノロジーで増幅したミトコンドリアDNAは次のような様々なダウンストリームアプリケーションに使用できます。
- ジェノタイピング（SNP、欠失、挿入等）
- エンドポイントPCRおよび定量リアルタイムPCR
- シークエンシング解析
裏付けデータと数値
Enrichment of mitochondrial DNA.
0.1 ng total DNA (representing approximately 15 cells) containing approximately 100 fg of mitochondrial DNA was amplified using the REPLI-g Mitochondrial DNA Kit. The total yield of mitochondrial DNA after amplification was up to 4 µg, corresponding to a 4 x 107-fold increase in mitochondrial DNA.
仕様
| 特徴 | 仕様 |
|---|---|
| amplification | Whole genomic DNA |
| samplesperrunthroughput | Mid |
| denaturationstep | Heat |
| maximuminputvolume | 10 µl template DNA |
| minimalpipettingvolumeneeded | 1 µl |
| reactionvolume | 50 µl |
| reactiontime | ~8 hours (overnight) |
| qualityassessment | No |
| applications | Genotyping, sequencing, RFLP |
| startingamountofdna | ~10 ng purified total DNA |
| startingmaterial | Genomic human DNA |
| technology | Multiple Displacement Amplification (MDA) |
| yield | ~4 µg |
リソース
サイエンティフィック・ポスター (4)
キットハンドブック (2)
パンフレット (1)
MSDS (1)
Supplementary Protocols (1)
クイックスタートプロトコール (1)
Application Notes (2)
User-Developed Protocols (2)
Certificates of Analysis (1)
出版物
Mitochondrial DNA mutation in normal margins and tumors of recurrent head and neck squamous cell carcinoma patients.
Cancer Prev Res (Phila); 2010; 3 (9):1205-11 2010 Jul 26 PMID:20660573