QuantiTect-PCR-Kits

• Hoch sensitiver Nachweis von Low-Copy-Zielen
• qPCR mit sequenzspezifischen Sonden oder SYBR Green
• Genaue Quantifizierung über mehrere logarithmische Größenordnungen an Template-Mengen
• Keine Optimierung der Reaktions- und Zyklusbedingungen erforderlich
• Nachweis von bis zu 5 Zielen in einem Röhrchen

QuantiTect-PCR-Kits (qPCR-Kits) ermöglichen die sensitive Quantifizierung von gDNA- und cDNA-Zielen mittels Real-time-PCR und Zwei-Schritt-RT-PCR unter Verwendung sequenzspezifischer Sonden oder SYBR Green I. Die Real-time-PCR-Kits erlauben außerdem die zuverlässige Quantifizierung von bis zu 5 gDNA- oder 5 cDNA-Zielen in einem einzigen Röhrchen mittels Real-time-PCR oder Zwei-Schritt-RT-PCR, jeweils im Multiplex-Format. Die Kombination aus Hot-Start und einem einzigartigen PCR-Puffersystem im gebrauchsfertigen Master-Mix gewährleistet eine hoch sensitive qPCR auf jedem Real-time-Thermocycler, ganz ohne Optimierung. Der dNTP-Mix enthält dUTP, was eine optionale Behandlung mit UNG ermöglicht. Die Master-Mixe in den QuantiTect-PCR-Kits können bei 2–8 °C gelagert werden.

Für die Multiplex-PCR mit sequenzspezifischen Sonden sind zwei Kit-Formate erhältlich: das QuantiTect Multiplex PCR Kit für Thermocycler, die ROX-Farbstoff zur Fluoreszenznormalisierung benötigen, und das QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit für alle anderen Thermocycler.

Die HotStarTaq DNA Polymerase, die in den quantitativen QuantiTect-PCR-Kits enthalten ist, erhöht die Spezifität der PCR-Reaktion, da sie im Vergleich zu anderen Polymerasen einen besonders stringenten Hot-Start ermöglicht.

QuantiTect SYBR Green PCR Kits ermöglichen eine spezifische Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich (siehe Abbildung „ Spezifische Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich“). In Kombination mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit und den QuantiTect Primer Assays liefern die QuantiTect SYBR Green PCR Kits sensitive und zuverlässige Ergebnisse (siehe Abbildung „ Spezifische und sensitive Quantifizierung“).

QuantiTect Probe PCR Kits liefern in Kombination mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit sensitive und zuverlässige Ergebnisse (siehe Abbildung „ Hohe Sensitivität und Effizienz sowie ein breiter dynamischer Bereich“). Die einzigartige Zusammensetzung des PCR-Puffers in den QuantiTect Probe PCR Kits sorgt für eine sensitive Quantifizierung von DNA-Zielen mit geringer Kopienzahl sowie für eine genaue Quantifizierung über einen breiten linearen Bereich (siehe Abbildung „ Breiter dynamischer Bereich in der Real-time-PCR“).

Der QuantiTect Multiplex PCR Master Mix gewährleistet, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in den entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktionen (siehe Tabelle “Vergleichbare C_Τ-Werte (Threshold Cycle) bei Triplex- und Singleplex-PCRs” und Abbildung “ Vergleichbare Ergebnisse bei der 4-Plex-PCR und den entsprechenden Singleplex-PCRs”.

Mit den Kits können schon 10 Kopien eines Zielgens nachgewiesen werden, selbst wenn die Kopienzahl des Referenzgens in derselben Reaktion bis zu 10⁶-fach höher ist (siehe Abbildung „“ Nachweis von 10 Kopien des Zielgens mit einem Überschuss an Referenzgen“ und die entsprechende Tabelle „Erfolgreiche quantitative Triplex-qPCR von Zielen mit geringer und hoher Abundanz“).

QuantiTect SYBR Green PCR Kits enthalten einen optimierten, gebrauchsfertigen Master-Mix für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von cDNA-Zielen mit SYBR Green I (siehe Tabelle “Komponenten des 2x QuantiTect SYBR Green PCR Kits”). Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I im Master-Mix ermöglicht die Analyse vieler verschiedener Ziele, ohne dass die Synthese von zielsequenzspezifischen, markierten Sonden erforderlich ist Eine ausgewogene Kombination von K⁺- und NH₄⁺-Ionen im PCR-Puffer sorgt für eine spezifische Primerhybridisierung und ermöglicht eine hohe Spezifität und Sensitivität der PCR (siehe Abbildung „Spezifische Primerhybridisierung“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders stringenten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.

QuantiTect Probe PCR Kits enthalten einen optimierten, gebrauchsfertigen Master-Mix für die hoch spezifische und sensitive Echtzeit-Quantifizierung von gDNA- und cDNA-Zielen mit sequenzspezifischen Sonden (siehe Tabelle “Komponenten des 2x QuantiTect Probe PCR Kits”). Die Kits sind für die Verwendung mit allen Arten von sequenzspezifischen Sonden ausgelegt, einschließlich für den Nachweis von Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan®- und anderer doppelt markierter Sonden), FRET-Sonden und Molecular Beacons. Die QuantiTect Probe PCR Kits enthalten einen einzigartigen PCR-Puffer, der eine ausgewogene Kombination von K⁺- und NH₄⁺-Ionen enthält, die für eine spezifische Primerhybridisierung sorgen und somit eine hohe Spezifität und Sensitivität der PCR ermöglichen (siehe Abbildung „Spezifische Primerhybridisierung“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders stringenten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.

QuantiTect Multiplex PCR Kits ermöglichen eine auf Anhieb erfolgreiche Zwei-Schritt-RT-PCR im Multiplex-Format (siehe Flussdiagramm „ QIAGEN Multiplex-Kits“). Der optimierte Master-Mix sorgt dafür, dass die PCR-Produkte in einer Multiplex-Reaktion mit der gleichen Effizienz und Sensitivität amplifiziert werden wie die PCR-Produkte in einer entsprechenden Singleplex-Amplifikationsreaktion. Mit dem Kit lassen sich schon 10 Kopien eines Zielgens detektieren.

Die Amplifikation von Referenz- und Zielgenen in derselben Reaktion statt in getrennten Reaktionen erhöht die Zuverlässigkeit der Genquantifizierung, indem Handhabungsfehler minimiert werden. Der QuantiTect Multiplex PCR Master-Mix enthält eine ausgewogene Kombination von K⁺- und NH₄⁺-Ionen sowie den einzigartigen synthetischen Faktor MP, die zusammen für eine stabile und effiziente Hybridisierung von Primern und Sonden an das Nukleinsäure-Template sorgen und so eine hohe PCR-Effizienz ermöglichen (siehe Tabelle „Komponenten des 2x QuantiTect Multiplex PCR Kits“). Darüber hinaus bietet die HotStarTaq DNA Polymerase einen besonders stringenten Hot-Start, der die Bildung von unspezifischen Produkten verhindert.

Die Master-Mixe in den QuantiTect-PCR-Kits enthalten außerdem dUTP, was eine Vorbehandlung mit Uracil-N-Glycosylase (UNG) vor dem Start der PCR ermöglicht. Dadurch wird gewährleistet, dass etwaige kontaminierende PCR-Produkte die nachfolgenden PCR-Reaktionen nicht beeinflussen.

Die Reaktionen können bei Bedarf mit Uracil-N-Glycosylase (UNG) vorbehandelt werden, um Verschleppungen von PCR-Produkten aus früheren Reaktionen zu eliminieren. Für optimale Ergebnisse bei der Zwei-Schritt-Real-time-RT-PCR empfehlen wir die Synthese von cDNA mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit. Das Kit ermöglicht eine schnelle cDNA-Synthese in nur 20 Minuten bei gleichzeitiger Entfernung von Kontaminationen durch genomische DNA.

QuantiTect SYBR Green und Probe PCR Kits machen die mühsame und zeitaufwändige Optimierung der Reaktionsbedingungen überflüssig. Geben Sie einfach Primer und DNA-Template zum gebrauchsfertigen PCR-Master-Mix und starten Sie die Reaktion. Befolgen Sie das Protokoll im Handbuch, um auf jedem Real-time-Thermocycler schnelle und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.

Bei Verwendung der QuantiTect SYBR Green PCR Kits in Kombination mit QuantiTect Primer Assays sind hoch spezifische Ergebnisse bei der Genexpressionsanalyse garantiert. Dabei handelt es sich um bioinformatisch validierte Primer-Sets für die genomweite Detektion von Transkripten von Mensch, Maus, Ratte und vielen anderen Spezies. QuantiTect Primer Assays können einfach online über GeneGlobe bestellt werden.

QuantiTect Multiplex PCR Kits enthalten gebrauchsfertige Master-Mixe, die eine Optimierung der Reaktions- und Zyklusbedingungen überflüssig machen. Das Handbuch enthält ein einziges Protokoll für alle verfügbaren Real-time-Thermocycler und eine Liste empfohlener Farbstoffe.

Die Kits sind mit oder ohne den passiven Referenzfarbstoff ROX im Master-Mix erhältlich, sodass sie auf praktisch jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden können (siehe Tabelle “Auswahl des richtigen QuantiTect Multiplex PCR Kits”). Dank der optimierten ROX-Konzentrationen lassen sich selbst niedrige Kopienzahlen durch automatische Datenanalyse nachweisen.

QuantiTect-PCR-Kits können für die Genexpressionsanalyse von cDNA oder die Quantifizierung von gDNA auf jedem Real-time-Thermocycler verwendet werden. Dazu gehören Geräte von Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Roche und Agilent. Für den Rotor-Gene Q und andere Rotor-Gene-Thermocycler empfehlen wir das Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit, Rotor-Gene Probe PCR Kit oder Rotor-Gene Multiplex PCR Kit, die alle speziell für schnelles Cycling auf diesen Geräten entwickelt wurden.